Изучение молекулярно-биологических свойств вариантов вакцинного штамма francisella tularensis с делетированными генами системы рекомбинации reca и recd


Скачать 310,57 Kb.
НазваниеИзучение молекулярно-биологических свойств вариантов вакцинного штамма francisella tularensis с делетированными генами системы рекомбинации reca и recd
страница1/3
Лапин Александр Александрович
Дата конвертации19.08.2012
Размер310,57 Kb.
ТипАвтореферат
СпециальностьМикробиология 03.01.03 - молекулярная биология
Год2011
На соискание ученой степениКандидат биологических наук
  1   2   3


На правах рукописи


Лапин

Александр Александрович


ИЗУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
ВАРИАНТОВ ВАКЦИННОГО ШТАММА FRANCISELLA TULARENSIS
С ДЕЛЕТИРОВАННЫМИ ГЕНАМИ СИСТЕМЫ
РЕКОМБИНАЦИИ RECA И RECD



03.02.03 – микробиология

03.01.03 – молекулярная биология


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук


Оболенск – 2011


Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека


Научные руководители:

Кандидат физико-математических наук Павлов Виталий Михайлович

Кандидат медицинских наук Мокриевич Александр Николаевич


Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук Гремякова Татьяна Андреевна

Кандидат биологических наук Воложанцев Николай Валентинович


Ведущая организация:

Федеральное бюджетное учреждение науки Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора


Защита состоится «____»___________ 2011 г. на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации по адресу: 142279, Московская обл., Серпуховский р-н, п. Оболенск, ФБУН ГНЦ ПМБ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»


Автореферат разослан «____»___________ 2011 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Н.К. Фурсова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Туляремия – зоонозная инфекция, имеющая природную очаговость. На территории Российской Федерации природные очаги туляремии распространенны повсеместно, поэтому наблюдаемый в настоящее время уровень заболеваемости (по данным ФГУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора, в 2010 г. зарегистрировано 115 случаев туляремии, по сравнению с 2009 г. – 57 случаев) представляет несомненную проблему для Российского здравоохранения.

Возбудителем туляремии является микроорганизм Francisella tularensis. В современной классификации выделяют четыре подвида Ftularensis: subsp. tularensis, subsp. holarctica, subsp. mediaasiatica и subsp. novicida. Наиболее тяжелую форму заболевания вызывает Ftularensis subsp. tularensis, циркулирующий на территории Северной Америки (Ellis et al., 2002).

Для профилактики туляремии в РФ используется живая вакцина, которая формирует длительный напряженный иммунитет. Основным недостатком данной вакцины является ее некоторая реактогенность и нестабильность (Олсуфьев с соавт., 1960). Поэтому в настоящее время актуальной проблемой является создание нового поколения стабильных и менее реактогенных вакцинных туляремийных штаммов. Одним из способов стабилизации генома вакцинного туляремийного штамма представляется инактивирование элементов системы гомологичной рекомбинации.

Известно, что инактивирование гена recA у вакцинного штамма Mycobacterium bovis BCG приводило к стабилизации генома данного микроорганизма и не влияло на его протективные свойства (Keller et al., 2008). Инактивация генов recA и recBC в клетках Salmonella приводила к снижению вирулентности для мышей и замедленному росту в макрофагах (менее выраженному в случае recA мутантов) (Buchmeier et al., 1993). Наличие дефекта в гене recD у Salmonella, продуктом которого является белок RecD, обладающий АТФ-азной (Chen et al., 1997) и хеликазной (Taylor et al., 2003) активностями, также приводило к аттенуации бактерий Salmonella для мышей и снижению их пролиферации в макрофагах (Cano et al., 2002).

Ранее было показано наличие функционально-активного recA-подобного гена в геноме вакцинного штамма Ftularensis (Павлов с соавт., 1991) и в геноме F. tularensis subsp. novicida (Berg et al., 1992). При сравнительном анализе нуклеотидной последовательности геномов видов Francisella были обнаружены также recD-подобные гены (Larsson et al., 2005).

Учитывая вышеизложенные факты, изучение влияния recA- и recD-подобных генов Ftularensis на генетические и биологические свойства вакцинного штамма туляремийного микроба является на настоящий момент актуальной задачей, решение которой необходимо для создания нового поколения вакцинного штамма, а также для изучения эволюции туляремийного микроба.

Цель исследования: изучение влияния генов системы гомологичной рекомбинации recA и recD на биологические и иммунологические свойства вакцинного штамма Ftularensis.

задачи исследования

  1. Биоинформационный анализ генов системы гомологичной рекомбинации recA и recD у Ftularensis.

  2. Получение вакцинного варианта штамма Ftularensis 15/10 с делетированным геном recA.

  3. Получение продуцента E. coli Bl21(DE3), экспрессирующего рекомбинантный белок RecA Ftularensis, выделение и очистка белка RecA.

  4. Получение антител к рекомбинантному белку RecA Ftularensis и анализ экспрессии белка RecA в клетках туляремийного микроба.

  5. Получение вакцинного варианта штамма Ftularensis 15/10 с делетированным геном recD.

  6. Изучение влияния генов recA и recD на свойства вакцинного штамма Ftularensis 15/10.

  7. Выбор последовательностей нуклеотидов в гене recD для ПЦР-диагностики с гибридизационно-флуоресцентной детекцией подвидов Ftularensis; конструирование праймера, содержащего Chi-сайт Ecoli, для дифференциации подвидов туляремийного микроба.

Научная новизна

Впервые получены варианты вакцинного штамма Ftularensis 15/10 с инактивированными генами системы гомологичной рекомбинации recA и recD. Показано, что при инактивации гена recA в геноме штамма Ftularensis 15/10 снижается вирулентность данного штамма, сохраняется его способность к персистенции в макрофагах и не ухудшаются вакцинные свойства. Установлено, что инактивация гена recD в геноме штамма Ftularensis 15/10 приводит к аттенуированию штамма, при сохранении его протективных свойств и значительном снижении способности к гомологичной рекомбинации. Впервые показано отсутствие индукции белка RecA в клетках штамма Ftularensis 15/10 после воздействия УФ-облучения и налидиксовой кислоты.

Практическая ценность работы

Созданы плазмиды pPVΔrecA, pPVΔrecD для аллельного обмена. Разработан алгоритм, позволяющий стабилизировать и аттенуировать вакцинный туляремийный штамм путем инактивации генов системы рекомбинации recA и recD. В Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур ФБУН ГНЦ ПМБ (ГКПМКК-Оболенск) депонированы авторские штаммы Ftularensis subsp. holarctica 15/10ΔrecA (рег. номер 6622.) с делецией гена recA, и Ftularensis subsp. holarctica 15/10 ΔrecD (рег. номер В-6823) с делецией гена recD (Федеральный уровень внедрения). Результаты исследований послужили основой для составления двух патентов на изобретение: «Способ стабилизации вакцинного туляремийного штамма» № 2010141704 от 11.10.2010 (Оболенск, 2010, Федеральный уровень внедрения) и «Способ аттеннуации вакцинного туляремийного штамма» №2011131560 от 28.07.2011 (Оболенск, 2011, Федеральный уровень внедрения). Материалы диссертации используются в программе подготовки аспирантов ФБУН ГНЦ ПМБ (учрежденческий уровень внедрения).

положения, выносимые на защиту

1. Делеция гена recA в геноме вакцинного штамма Ftularensis 15/10 приводит к снижению способности данного штамма к гомологичной рекомбинации. Инактивация гена recA сопровождается повышением чувствительности к ультрафиолетовому излучению. Полученный штамм F. tularensis 15/10∆recA сохраняет свои ростовые свойства и способность к размножению в макрофагах и не меняет свою устойчивость к бактерицидному действию нормальной кроличьей сыворотки. Жизнеспособность лиофильно высушенной культуры F. tularensis 15/10∆recA не меняется в процессе ее хранения.

2. Антитела к рекомбинантному белку RecA распознают нативный белок RecA штамма Ftularensis 15/10. Количество белка RecA в клетках штамма Ftularensis 15/10 после воздействия УФ-облучения и налидиксовой кислоты не меняется.

3. Делеция гена recD в геноме штамма Ftularensis 15/10 приводит к подавлению гомологичной рекомбинации. Штамм F. tularensis 15/10∆recD не меняет свою устойчивость к бактерицидному действию нормальной кроличьей сыворотки, обладает пониженными ростовыми свойствами и замедленной способностью к размножению в макрофагах, по сравнению с исходным вакцинным туляремийным штаммом.

4. У штамма Ftularensis 15/10 с инактивированным геном recA на порядок снижена вирулентность для мышей, при сохранении его протективных свойств. Делеция гена recD у вакцинного туляремийного штамма приводит к его аттенуированию и сохранению протективных свойств.

5. Созданная система праймеров и зондов на основе вариабельной последовательности гена recD позволяет проводить дифференциацию подвидов туляремийного микроба методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Сконструированный праймер, содержащий Chi-последовательность E.coli, позволяет различать подвиды туляремийного микроба методом ПЦР.

Работа выполнена в лаборатории микробиологии туляремии (ЛМТ) ФБУН ГНЦ ПМБ по Государственным контрактам № 118-Д от 11.06.2009 г. и № 124-Д от 11.06.2009 г. в рамках Федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009–2013 гг.)».


Апробация работы

Материалы диссертации доложены и представлены на: научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 25-27 мая 2010 г., 31 мая- 2 июня 2011 г.), III научно-практической школе-конференции «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 31 мая- 2 июня 2011 г.) и на третьем съезде военных врачей медико-профилактического профиля вооруженных сил Российской Федерации (Санкт-Петербург, 8-10 декабря 2010 г.) «Достижения науки и практики в обеспечении санитарно-эпидемиологического благополучия вооруженных сил Российской Федерации». Апробация диссертации состоялась на заседании межлабораторного семинара ФБУН ГНЦ ПМБ 21 июня 2011 г.

Публикации

Основное содержание работы отражено в 9 научных публикациях, в том числе в 4 статьях журнала из списка изданий, рекомендованного ВАК, а также в двух принятых к рассмотрению заявках на патент Российской Федерации.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 20 работ отечественных и 151 работы зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 31 рисунками и 14 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Обзор литературы

В первых главах приведены данные о возбудителе туляремии и лабораторной диагностики данной инфекции. Изложена история получения и использования туляремийного вакцинного штамма. Проанализированы литературные данные, касающиеся функционирования системы гомологичной рекомбинации у микроорганизмов. Приведена история исследования модели гомологичной рекомбинации. Основная часть обзора посвящена работам по исследованию функционирования основных ферментов системы гомологичной рекомбинации - белкам RecA и RecBCD. Приведены данные об организации генома Ftularensis. Рассмотрены подходы генетического изучения туляремийного микроба. Заключительная часть литературного обзора посвящена вопросу применения генетической модификации системы рекомбинации у вакцинных штаммов в том числе и Ftularensis, для стабилизации и аттенуации вакцинных штаммов.

Глава 2. Материалы и методы исследования

В работе использовали полученные из коллекции ГКПМКК-Оболенск бактериальные штаммы: - Ftularensis subsp. tularensis - 3 штамма, Ftularensis subsp. mediasiatica - 2 штамма, F. tularensis subsp. Novicida - 1 штамм, F. tularensis subsp. holarctica - 6 штаммов, из которых F. tularensis subsp. holarctica biovar japonica - 3 штамма и вакцинный штамм F. tularensis, subsp. holarctica 15/10, а также гетерологичные штаммы Y. pestis EV76, Y. pseudotuberculosis 1779, B. anthracis СТИ-1 и E. coli JM 83, E. coli DH5α, E. coli S17-1 и E. coli Bl21(DE3).

Мышиные макрофагоподобные клетки линии J744.A1 были получены из Российской Коллекции клеточных культур, г. Санкт-Петербург, Россия.

В работе были использованы мыши линии BALBc (возраст 6-8 нед.) и беспородные белые мыши массой 18-20 г, полученные из вивария ФБУН ГНЦ ПМБ, соответствующие требованиям к качеству лабораторных грызунов (Лившиц, 1978).

Культивирование штаммов E. coli проводили на жидких и плотных питательных средах Лурия-Бертани (LB) при температуре 37 °С (Miller, 1972) с добавлением при необходимости антибиотиков: хлорамфеникола (Cm) 10 мг/л, ампициллина (Ap) 100 мг/л, канамицина (Km) 40 мг/л и 5% сахарозы (Suc). Культивирование штаммов F. tularensis проводили при температуре 37 ºС на среде FT-агар (ФБУН ГНЦ ПМБ) и жидкой питательной среде (Лапин с соавт., 2009), при необходимости в питательные среды добавляли антибиотики: полимиксин (Pm) 100 мг/л, Km 10 мг/л, Cm 3 мг/л, стрептомицин (Str) 100 мг/л и 5% Suc.

Лиофильное высушивание подготовленных суспензий объемом 2 мл проводили с использованием сушилки Bench Top SLC "Virtis" 4 k (США) при автоматическом режиме подвода тепла (20÷30 0С) в течение 24 ч (глубина вакуума - 200 мТорр).

Молекулярно-биологические работы выполняли в соответствии с руководством Маниатиса с соавт. (1984). Перенос рекомбинантных плазмид в клетки штаммов E. coli осуществляли “кальциевым” методом трансформации, а в клетки Ftularensis15/10 - методом конъюгации (Golovliov et al., 2003).

Олигонуклеотиды синтезировали в компании ЗАО «Синтол» (Москва, Россия).

ПЦР проводили с использованием термоциклера Gene Amp PCR System 2700 (Applied Biosystems,США).

ПЦР в реальном времени проводили на приборе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, Inc, США) c оптическим ПЦР-модулем.

Секвенирование нуклеотидных последовательностей ДНК проводили с использованием метода Сэнгера на секвенаторе ALF express II (Amersham Pharmacia Biotech, США) в компании «Синтол» (Москва, Россия).

Конструирование штаммов с делетированными генами системы рекомбинации recA и recD на основе штамма Ftularensis subsp. holarctica 15/10 проводили с помощью аллельного обмена по методике Golovliov et al (2003). Для синтеза модифицированных фрагментов генов recA и recD использовали ампликоны, полученные с помощью праймеров FSA, RBA, FBA, RSA и FSD, RBD, FBD, RSD, соответственно. Дефектные аллели генов recA и recD встраивали в SalI сайт суицидного вектора pPV. Для комплементации мутаций в генах recA и recD, фрагменты хромосомной ДНК Ftularensis 15/10 с функционально активным геном recA встраивали в SalI сайт вектора pHV33 mob, а фрагмент ДНК с геном recD - в SalI сайт векторов pHV33-mob и pUC19/pK194. Для получения плазмиды pET23(b+)/RecA-(His)6, экспрессирующей белок RecA Ftularensis в клетках Ecoli, ген recA Ftularensis 15/10 встраивали между сайтами NdeI и XhoI в векторе pET23(b+).

Очистку рекомбинантного белка RecA из цитоплазматической фракции штамма-продуцента E. coli Bl21 (pET23(b)+/RecA-(His)6) проводили металл-хелатирующей хроматографией в неденатурирующих условиях на носителе Ni2+NTAHisBind® Superflow™(Pharmacia Biotech, Швеция).

Концентрацию белка определяли по методу Lowry et al. (1951), электрофорез белков проводили по методу Лэмли (Laemly, 1970).

Иммуноблоттинг проводили по методу Товбина (Towbin et al., 1979). Иммуноферментный анализ (ИФА) проводили согласно руководству (Ngo 1988).

Индукцию белка RecA Ftularensis 15/10 проводили с использованием налидиксовой кислоты при концентрации 40 мг/л (Weinstock et al., 1979) и с помощью УФ-облучения при длине волны 245 нм.

Чувствительность бактерий к перекиси водорода (H2О2) определяли диско-диффузионным методом с помощью дисков диаметром 5 мм.

Определение чувствительности клеток туляремийного микроба к УФ-облучению проводили с помощью UV-облучателя при длине волны 245 нм (Cole Parmer, США).

Устойчивость микробов к бактерицидному действию нормальной кроличьей сыворотки (НКС) оценивали по выживаемости бактерий в суспензии плотностью 1×106 КОЕ/мл после инкубирования с сывороткой при температуре 37 °С в течение 24 ч.

Эффективность размножения клеток туляремийного микроба в макрофагах оценивали по разнице между десятичными логарифмами КОЕ, полученными при высевах лизатов макрофагов через 3 ч и 48 ч после инфицирования клетками штаммов F. tularensis.

Определение LD50 проводили согласно методу Кербера в модификации (Ашмарин, 1962).

Для оценки протективности модифицированных туляремийных штаммов вакцинированных мышей заражали подкожно культурой F. tularensis 503 в дозе 1102 КОЕ/мышь (DCL штамма F. tularensis 503 для мышей линии BALB/c составляет 1 КОЕ/мышь) через 28 суток после вакцинации. Достоверность отличий количественных значений экспериментов определяли по t-критерию Стьюдента (P<0,05) с помощью статиcтических программ, встроенных в программу Windows Excel.


  1   2   3

Разместите кнопку на своём сайте:
поделись


База данных защищена авторским правом ©dis.podelise.ru 2012
обратиться к администрации
АвтоРефераты
Главная страница