Полиморфные варианты генома человека и риск развития острого инсульта


Скачать 339,36 Kb.
НазваниеПолиморфные варианты генома человека и риск развития острого инсульта
страница1/3
Бондаренко Елена Александровна
Дата конвертации19.08.2012
Размер339,36 Kb.
ТипАвтореферат
СпециальностьМолекулярная биология
Год2011
На соискание ученой степениКандидат биологических наук
  1   2   3


На правах рукописи


Бондаренко Елена Александровна


Полиморфные варианты генома человека и риск развития острого инсульта


03.01.03 – Молекулярная биология


Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук


Москва – 2011


Работа выполнена в Отделе молекулярных основ генетики человека Учреждения Российской академии наук Института молекулярной генетики РАН


Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Петр Андреевич Сломинский

Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН


Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Валерий Вячеславович Носиков

ФГУП «ГосНИИ генетика»


кандидат биологических наук

Генинг Леонид Владимирович

Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН


Ведущая организация: Учреждение Российской академии

медицинских наук Медико-генетический

научный центр РАМН


Защита диссертации состоится «__»________________2011 г. в _____часов

на заседании Диссертационного совета Д.217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, Россия, Москва, 1-ый Дорожный проезд, д.1. Тел: (495) 315-3747.


С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов».

Автореферат разослан «__»________________ 2011


Ученый секретарь

диссертационного совета, Т.Л. Воюшина

кандидат химических наук

Общая характеристика работы


Актуальность проблемы

Сосудистые заболевания головного мозга – актуальная медицинская и социальная проблема. На сегодняшний день 9 миллионов человек в мире страдают цереброваскулярными болезнями. Основное место среди них занимают инсульты, каждый год поражающие около 6 миллионов человек и уносящие 4,6 миллиона жизней. Смертность от церебральных заболеваний в экономически развитых странах составляет 11–12% и уступает лишь смертности от заболеваний сердца и опухолей всех локализаций.

В последние годы отмечается рост распространенности заболеваний острыми нарушениями мозгового кровообращения. Ежегодно в России переносят инсульты более 400000 – 450000 человек. При этом наблюдается «омоложение» инсульта с увеличением его распространенности среди лиц трудоспособного возраста (до 64 лет). Инсульт является лидирующей причиной инвалидизации населения. По данным Национального регистра, 31% пациентов, перенесших инсульт, требуется постоянный уход, а 20% не могут самостоятельно ходить. Лишь около 20% выживших больных способны вернуться к прежней работе.

Многочисленные эпидемиологические исследования доказали важность роли генетической составляющей в частоте развития сосудистых заболеваний головного мозга. Инсульт, за исключением относительно редко встречающихся моногенных форм, при которых структурные особенности определенных генов являются определяющим фактором развития заболевания, – это мультифакторное заболевание, в формировании которого имеют значение как внешние (средовые) факторы, так и индивидуальные генетические особенности. Сложность патогенеза создает большие трудности при изучении природы этого заболевания.

В настоящее время в изучении генетической предрасположенности инсульта, равно как и других мультифакторных заболеваний, используются два основных подхода: анализ генетических ассоциаций с полиморфными вариантами кандидатных генов заболевания и полногеномный ассоциативный анализ.

Первоначальные исследования инсульта с применением анализа генетических ассоциаций были сфокусированы на отдельных генах-кандидатах, которые, как предполагалось, вовлечены в биологические процессы, нарушения которых могли приводить к развитию заболевания. Исследовавшиеся гены-кандидаты были ассоциированы, например, с такими патологиями как атеросклероз, тромбозы и артериальная гипертензия. Статистически достоверные ассоциации с различными типами инсульта были показаны для однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) с.1691G>A в гене фактора свертывания крови V (F5), с.20210G>A в гене протромбина (F2), c.675_676delinsG в гене, кодирующем ингибитор активатора плазминогена-1 (PAI-1) и полиморфизмов в гене, кодирующем GPIbα субъединицу тромбоцитарного рецептора (GP1BA). Белковые продукты этих генов вовлечены в систему гемостаза. Ассоциации с риском развития острого инсульта были показаны и для инсерционно-делеционного (I/D) полиморфизма в гене ангиотензин-превращающего фермента (ACE). Однако полученные данные не дают однозначного ответа на вопрос об их патогенетической роли в развитии инсульта. Для изучения вклада полиморфизмов генов в риск развития заболевания необходимо учитывать и этническую компоненту. В российской популяции полиморфизмы c.20210G>A гена F2, c.1691G>A гена F5, (-5)T>C Kozak гена GP1BA, c.675_676delinsG гена PAI-1 изучены достаточно слабо.

Применение новейших технологий полногеномного анализа сцепления в семьях позволило выявить два ранее неизученных гена, показавших высокую ассоциацию с риском развития ишемического инсульта в исландской популяции – фосфодиэстеразы 4D (PDE4D), и ALOX5AP, кодирующий активатор 5-липоксигеназы. В последние несколько лет полногеномный ассоциативный анализ на выборках большого объема из разных этнических групп выявил еще 11 новых локусов, которые могут быть вовлечены в патогенез острого и, в частности, ишемического инсультов.

Проведение работ по анализу полиморфизмов генов, которые могут быть вовлечены в патогенез инсульта, позволит с одной стороны лучше понять причины и механизмы развития этого заболевания, а с другой – разработать молекулярно-генетические тесты для определения риска развития острого инсульта и его ранней диагностики. Возможность проведения доклинической диагностики этого заболевания позволит начать разработку принципов и подходов профилактического лечения.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы являлись поиск и анализ генетических маркеров риска развития острого инсульта, а также его подтипов – ишемического и геморрагического в российской популяции.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

  1. Проведение анализа полиморфных ДНК-маркеров в кандидатных генах острого инсульта F2, F5, GP1BA, ACE, ALOX5AP и PDE4D у пациентов с ишемическим и геморрагическим инсультом.

  2. Поиск новых ДНК-маркеров острого инсульта с использованием метода полногеномного ассоциативного анализа.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые в диссертационной работе определены частоты полиморфных вариантов генов ALOX5AP (SG13S114, SG13S32, SG13S89, SG13S25) и PDE4D (SNP41, SNP87, SNP45) у больных острым, ишемическим и геморрагическим инсультом и здоровых индивидов, принадлежащих к русскому этносу.

Проведен анализ ассоциаций полиморфных локусов генов F2, F5, GP1BA, PAI-1, ACE с риском развития острого инсульта и его подтипов – ишемического и геморрагического в российской популяции. С помощью программы «GMDR» исследованы межгенные взаимодействия у больных острым, ишемическим и геморрагическим инсультом и здоровых индивидов, принадлежащих к русскому этносу.

Выявлены генетические маркеры риска развития заболевания у индивидов с острым, ишемическим и геморрагическим инсультом, а также изучена их взаимосвязь с этими заболеваниями с учетом пола в российской популяции.

Впервые проведен корреляционный анализ между полиморфизмами c.20210G>A гена F2, c.1691G>A гена F5, (-5)T>C Kozak гена GP1BA, c.675_676delinsG гена PAI-1, g.11417_11704del287 гена ACE, SNP41, SNP87, SNP45 гена PDE4D, и SG13S114, SG13S32, SG13S89, SG13S25 гена ALOX5AP и клиническими характеристиками острого инсульта.

Впервые с помощью технологии ДНК-микрочипов проведен полногеномный ассоциативный анализ (GWAS) острого ишемического инсульта в российской популяции и выявлены новые ДНК-маркеры этого типа инсульта.

Результаты работы вносят вклад в общее представление о генетических основах предрасположенности к инсульту. Полученные данные позволяют оценить роль ряда генетических систем в развитии острого инсульта и его подтипов – ишемического и геморрагического, и являются основанием для разработки молекулярно-генетических методов определения лиц с повышенным риском развития данных заболеваний. Результаты молекулярно-генетического анализа полиморфных участков генов-кандидатов инсульта могут использоваться для медико-генетического консультирования с целью раннего выявления лиц с высоким риском развития заболевания и проведения донозологической профилактики. Учитывая результаты генотипирования больных острым инсультом и его подтипами, можно выделить группы пациентов с более тяжелым течением заболевания и дифференцировать у них лечебно-профилактические мероприятия, что важно для прогностических целей.

Публикации

Основные результаты исследования опубликованы в 10 работах, включая 6 статей в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ для защиты диссертаций.

Апробация диссертации

Результаты, полученные в данной работе, были представлены на III Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (1-4 октября 2009 г., Ростов-на-Дону, Россия), VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (14-18 мая 2010г., Ростов-на-Дону, Россия), на конференциях Европейского Общества Генетики человека (ESHG) (28-31мая 2011г., Амстердам, Нидерланды) и «The biology of genomes» (10-14 мая 2011г., Cold Spring Harbor, New York). Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседании Ученого совета ИМГ РАН 17 октября 2011 г. и на заседании секции «Молекулярная биология» Ученого совета ФГУП «ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов» 26 октября 2011 г.

Структура и объем диссертации

Диссертация включает: введение; обзор литературы; материалы и методы исследования; результаты и обсуждение; заключение; выводы; библиографический указатель. Список литературы состоит из 304 источников, среди которых 19 источников отечественной и 285 источников зарубежной литературы. Материалы диссертации изложены на страницах машинописного текста, содержат таблицу и рисунков.


Содержание работы

Материалы и методы исследования

В настоящей работе был проведен анализ группы больных острым инсультом, славян из российской популяции, в остром периоде церебрального инсульта, поступивших в неврологическую клинику ГКБ №31 кафедры фундаментальной и клинической неврологии ГОУ ВПО Российского государственного медицинского университета Росздрава за период 2007-2010 гг., соответствовавших критериям включения в исследование (N=1234). Возраст больных составлял от 18 до 98 лет (средний возраст 67,6 ± 12,3). В исследование вошло 611 женщин и 623 мужчины. Диагноз острый инсульт был поставлен на основании анализа совокупности данных анамнеза, физикального обследования, исследовании соматического и неврологического статусов, биохимических показателей крови и клинико-инструментальной диагностики. В качестве контроля использовалась группа славян из российской популяции в количестве 717 человек без инсультов в анамнезе. Возраст составлял от 20 до 88 лет (средний возраст 46,3 ± 11,4). В данной группе 46% мужчин и 54% женщин. Все образцы крови были взяты с информированного согласия исследуемых лиц.

Для типирования полиморфных вариантов изучаемых генов-кандидатов острого инсульта и проведения полногеномного ассоциативного анализа были использованы препараты ДНК, полученные из цельной крови с использованием набора «AxyPrep Blood GDNA Miniprep Kit» («Axygen», США) согласно рекомендациям производителя. Выделение геномной ДНК из лейкоцитов венозной крови образцов контрольной группы проводилось стандартным методом фенол-хлороформной экстракции (Sambrook et al., 1989).

Анализ полиморфизмов c.20210G>A гена F2 (rs1799963), c.1691G>A гена F5 (rs6025), (-5)T>C Kozak гена GP1BA (rs2243093), c.675_676delinsG гена PAI-1 (rs34857375), SG13S114 (rs10507391), SG13S32 (rs9551963), SG13S89 (rs4769874), SG13S25 (rs17222814) гена ALOX5AP и SNP87 (rs2910829), SNP41 (rs152312), SNP45 (rs12188950) гена PDE4D проводили методом ПЦР в реальном времени с использованием TaqMan зондов. Праймеры и зонды для анализа однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) генов F2, F5, GP1BA, SG13S25 гена ALOX5AP, SNP45 гена PDE4D подбирали с помощью программы Vector NTI Suite 9 (Invitrogen, Carlsbad, CA, США). Система «праймеры-зонд» для полиморфизма c.675_676delinsG гена PAI-1 была опубликована ранее (Wiklund et al., 2005), SG13S32 и SG13S114 гена ALOX5AP (Kajimoto et al., 2005), SG13S89 гена ALOX5AP (Hsieh и др., 2008) и SNP41, SNP87 гена PDE4D (Hsieh et al., 2009). Для амплификации 16 интрона гена АПФ, содержащего делецию 256 п.н., использовали ранее опубликованные праймеры (Rigat et al., 1992).

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета программ STATISTICA (data analysis software system, version 6.0. www.statsoft.com). Для расчета отношения шансов применяли программное обеспечение GraphPad InStat (США) (http://www.graphpad.com/). Для расчёта соответствия распределения генотипов в популяционной выборке закону Харди-Вайнберга использовали программное обеспечение Hardy-Weinberg equilibrium calculator (http://www.oege.org/software/hwe-mr-calc.shtml). Анализ межгенных взаимодействий проводился с помощью программы GMDR (Generalized Multifactor-Dimensionality Reduction) (http://sourceforge.net/projects/gmdr/).

Для проведения полногеномного ассоциативного анализа были сформированы две выборки: выборка больных острым инсультом (N=1290) и контрольная выборка, состоящая из независимых выборок из Ивановской, Владимирской, Смоленской, Курской и Тверской областей (N=740). Полногеномный анализ проводился ЗАО «Геноаналитика», Россия с использованием ДНК-микрочипов «HumanCytoSNP-12 v.2» ("Illumina", США). Статистическая обработка результатов полногеномного ассоциативного анализа проводилась с помощью программного обеспечения «Genome Studio» "Illumina", США, «SNP & Variation Suite v.7», "Golden Helix", США.

Результаты исследования

    1. Анализ генов-кандидатов острого инсульта.

      1. Анализ ОНП в генах, кодирующих белки системы свертывания крови и гемостаза

Было изучено 4 полиморфных локуса генов, белковые продукты которых вовлечены в систему гемостаза – c.20210G>A гена F2, c.1691G>A гена F5, (-5)T>C Kozak гена GP1BA, c.675_676delinsG гена PAI-1. Частоты генотипов и аллелей сравнивали между группами больных острым (N=1232) ишемическим (N=1009) геморрагическим (N=222) инсультом и контрольной выборкой (N=717), а также между выборками больных острым инсультом и контрольной группой, дифференцированными по полу. Достоверным считали уровень значимости p<0.05.

Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов F2, F5, GP1BA и PAI-1 не выявил достоверных различий между группами больных острым инсультом, его подтипами (ишемическим и геморрагическим) и контрольной группой. Для ОНП c.20210G>A гена F2, c.1691G>A гена F5 и (-5)T>C Kozak гена GP1 не было показано достоверных отличий в частотах распространения генотипов и аллелей между больными острым инсультом и соответствующими контрольными группами мужчин и женщин. Только для ОНП c.675_676delinsG гена PAI-1 в группе женщин с острым инсультом в анамнезе наблюдается статистически достоверное увеличение частоты аллеля 5G по сравнению с соответствующей ей по полу контрольной группой (p=0.04, ОШ=1.2; 95%ДИ 1.0–1.5). Таким образом, полиморфизмы c.20210G>A гена F2, c.1691G>A гена F5 и (-5)T>C Kozak гена GP1 не влияют на риск развития острого инсульта, а также его подтипов – ишемического и геморрагического в российской популяции. Данные полиморфизмы не увеличивают риск развития острого инсульта, как у мужчин, так и у женщин. Ассоциация с полиморфизмом c.675_676delinsG в гене PAI-1 наиболее выражена у женщин. Наличие аллеля 5G увеличивает риск развития острого инсульта в 1.2 раза, и не оказывает влияние на риск развития данного заболевания у мужчин.

      1. Анализ g.11417_11704del287 полиморфизма в гене, кодирующем ангиотензин-превращающий фермент (ACE).

Наиболее изученным полиморфизмом в гене ACE является инсерционно-делеционный полиморфизм (I/D полиморфизм) в 16 интроне, который заключается в наличии (вставка, или инсерция – аллель I) или отсутствии (выпадение, или делеция – аллель D) фрагмента в 287 п.н. (Alu-повтор). Данный полиморфизм был ассоциирован с активностью ангиотензин-превращающего фермента в плазме крови и тканях. Показаны статистически достоверные ассоциации между различными подтипами инсульта и D/D генотипом на выборках европейского и неевропейского происхождения. В настоящей работе был проведен анализ I/D полиморфизма (g.11417_11704del287) гена ACE. Частоты генотипов и аллелей сравнивали между группами больных острым инсультом (N=1100), ишемическим (N=903), геморрагическим инсультом (N=195) и контрольной выборкой (N=458), а также между выборками больных острым инсультом и контрольной группой, дифференцированными по полу.

Проведенный сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного варианта g.11417_11704del287 гена ACE показал отсутствие ассоциаций с острым инсультом и его подтипами. Наличие аллеля D не влияло на риск развития острого инсульта ни у мужчин, ни у женщин.

      1. Анализ полиморфизмов rs10507391 (SG13S114), rs9551963 (SG13S32), rs4769874 (SG13S89) и rs17222814 (SG13S25) в гене ALOX5AP

Был проведен анализ полиморфизмов SG13S114, SG13S32, SG13S89, SG13S25 гена ALOX5AP. Частоты генотипов и аллелей данных ОНП сравнивали между группами больных острым (N=1234), ишемическим (N=1009), геморрагическим (N=222) инсультом и контрольной выборкой (N=717), а также между выборками больных острым инсультом и контрольной группой, дифференцированными по полу.

Для ОНП SG13S89 гена ALOX5AP не было обнаружено статистически достоверных ассоциаций с риском развития острого инсульта или его подтипов – ишемического и геморрагического. Для данного ОНП не было показано достоверных различий в частотах распространения генотипов и аллелей между больными острым инсультом и соответствующими контрольными группами мужчин и женщин.

Для ОНП SG13S32 гена ALOX5AP не было выявлено статистически достоверных ассоциаций с риском развития острого и ишемического инсульта. В выборке больных геморрагическим инсультом носители аллеля С (лица с генотипами A/C и C/C) встречались на 6.7% чаще, чем в контроле (p=0.04; ОШ=1.5; 95%ДИ 1– 2.3) (табл.1). Для данного ОНП гена ALOX5AP, также как и для локуса SG13S89, не наблюдалось достоверных различий в частотах распространения генотипов и аллелей между больными острым инсультом и соответствующими контрольными группами мужчин и женщин.

Таблица 1. Частоты генотипов и аллелей однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) в гене ALOX5AP

ОНП

Острый инсульт

Ишемический инсульт

Геморрагический инсульт

Контрольная группа

SG13S114

TT/TA/AA

(T/A)


0.54/0.39/0.07

(0.73/0.27)


0.54/0.38/0.08

(0.73/0.27)


0.55/0.40/0.05

(0.75/0.25)


0.50/0.40/0.10

(0.70/0.30)

SG13S32

AA/AC/CC

(A/C)


0.22/0.50/0.28

(0.47/0.53)


0.23/0.49/0.28

(0.48/0.52)


0.17/0.55/0.28

(0.44/0.56)


0.23/0.51/0.26

(0.49/0.51)

SG13S89

GG/GA/AA

(G/A)


0.92/0.08/0

(0.96/0.04)


0.92/0.08/0

(0.96/0.04)


0.93/0.07/0

(0.96/0.04)


0.93/0.07/0

(0.97/0.03)

SG13S25

GG/GA/AA

(G/A)


0.78/0.20/0.02

(0.88/0.12)


0.78/0.20/0.02

(0.88/0.12)


0.80/0.18/0.02

(0.89/0.11)


0.85/0.14/0.01

(0.92/0.08)
  1   2   3

Разместите кнопку на своём сайте:
поделись


База данных защищена авторским правом ©dis.podelise.ru 2012
обратиться к администрации
АвтоРефераты
Главная страница