Регуляция процессов пролиферации и апоптоза компонентами сфингомиелинового цикла при гепатоканцерогенезе


Скачать 302,46 Kb.
НазваниеРегуляция процессов пролиферации и апоптоза компонентами сфингомиелинового цикла при гепатоканцерогенезе
страница1/4
ЗАВАРЗИН Виталий Александрович
Дата конвертации25.08.2012
Размер302,46 Kb.
ТипАвтореферат
СпециальностьОнкология 14.00.16 - патологическая физиология
Год2007
На соискание ученой степениКандидат медицинских наук
  1   2   3   4
На правах рукописи




ЗАВАРЗИН Виталий Александрович


РЕГУЛЯЦИЯ ПРОЦЕССОВ ПРОЛИФЕРАЦИИ И АПОПТОЗА КОМПОНЕНТАМИ СФИНГОМИЕЛИНОВОГО ЦИКЛА

ПРИ ГЕПАТОКАНЦЕРОГЕНЕЗЕ


14.00.14 – онкология

14.00.16 – патологическая физиология


АВТОРЕФЕРАТ


диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук


ТОМСК – 2007

Работа выполнена

в ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Росздрава,

ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН


Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Серебров Владимир Юрьевич

доктор медицинских наук Кондакова Ирина Викторовна


Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Чердынцева Надежда Викторовна

доктор медицинских наук, профессор Агафонов Владимир Иванович


Ведущая организация: ФГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина (РОНЦ) РАМН, г. Москва


Защита состоится ____ февраля 2007 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д. 001. 032. 01 при НИИ онкологии Томского научного центра СО РАМН (634009, Россия, г. Томск, пер. Кооперативный 5).


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ онкологии Томского научного центра СО РАМН


Автореферат разослан __________________ 2006 г.


Ученый секретарь диссертационного совета,

д.м.н. Фролова И.Г.


ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ


Актуальность темы. Рак печени различного генеза в настоящее время имеет широкую распространенность и является острейшей медико – социальной проблемой. Ежегодно в мире от гепатоцеллюлярной карциномы погибает 1 25000 человек. Заболеваемость этим злокачественным новообразованием имеет географические отличия. В Европе злокачественные опухоли гепатобилиарной зоны встречаются у 1 – 3 чел. на каждые 100 тыс. населения, в различных регионах Африки и Дальневосточной Азии ими заболевают 10 – 15 чел. на 100 тыс. населения [Шерлок Ш., Дули Дж., 1999]. В России первичный рак печени составляет 3 – 5 % в общей структуре злокачественных новообразований. Ежегодно регистрируется более 8000 новых случаев заболевания. Мужчины заболевают в 2 раза чаще, чем женщины. В 1992 году показатель заболеваемости раком печени и внутрипеченочных желчных протоков в России составил 5,7 на 100000 населения, а в 2001 году - 4,9 на 100000 населения [Ганцев Ш.Х., 2004]. В России наибольшие показатели заболеваемости данным злокачественным новообразованием были отмечены в республике Саха (Якутия) – 11,0 на 100000 населения.

Исследование механизмов гепатоканцерогенеза является актуальной задачей современной онкологии. Известно, что злокачественная трансформация сопровождается прибавлением клеточной массы, которое опережает клеточную гибель либо за счет активации процессов пролиферации, либо вследствие угнетения процессов апоптоза, а чаще всего - за счет сочетанного нарушения этих обоих процессов [Григорьев М.Ю. 2003; Фильченков А.А., 1998; Wells A., 1999]. Блокирование процесса апоптоза, связанное с постоянным действием промоторов опухолевого роста, приводит к фенотипическим изменениям трансформированных клеток, которые приобретают повышенную способность к пролиферации и утрачивают способность к дифференцировке. Благодаря этим свойствам они имеют преимущества перед клетками нормальных тканей при росте и выживании в одинаковых условиях [Лихтенштейн А.В., Шапот В.С., 1998; Cohen J.J., 1993].

Долгое время считалось, что традиционно используемые в онкологической практике лекарственные препараты вызывают гибель опухолевых клеток путем повреждения ДНК или блокирования в них важнейших путей метаболизма [Стручков В.А., Стражевская Н.Б., 2000]. Сейчас достоверно известно, что антибластомная активность многих из этих препаратов также связана со способностью индуцировать в клетках – мишенях апоптоз [Фильченков А.А., 1998; Eastman A., 1990; Sachs L., 1993; Story M., 1998]. Поэтому поиск и отбор лекарственных средств, способных индуцировать апоптоз, представляет собой важное направление в оптимизации схем терапии злокачественных новообразований.

Благодаря успеху липидологии стало известно, что липиды являются не только основным структурными элементом клеточных мембран, но также играют определяющую роль в различных клеточных процессах, в том числе - пролиферации и апоптозе. Важное значение в регуляции клеточных функций принадлежит продуктам расщепления сфингомиелина: церамиду и сфингозину [Liskovich M., 1994; Hakomory S. – 1995; Hannun Y.A., 1996; Divecha N., 1995]. Известно, что сфинголипиды являются иммуномодуляторами и вторичными мессенджерами, играющими существенную роль в гистогенезе тканей, росте и дифференцировке клеток, онкогенезе [Алесенко А.В 1998; Дятловицкая Э.В. 1998; Стручков В.С., Стражевская Н.Б.2000; Hannun Y.A., 1997; Don, M.D. Rockey, 2001; Divecha N., 1995].

Актуальной задачей является изучение роли компонентов сфингомиелинового цикла в регуляции пролиферации и апоптоза при гепатоканцерогенезе, что в дальнейшем может служить основой для поиска новых препаратов, применение которых позволит существенно снизить риск развития рака печени и улучшить результаты химиотерапии больных данной патологией.

Цель работы - изучить роль компонентов сфингомиелинового цикла в регуляции процессов пролиферации и апоптоза при экспериментальном гепатоканцерогенезе.

Задачи исследования:

1. Оценить влияние сфингомиелина и церамида на морфологическую картину печени крыс в процессе экспериментального гепатоканцерогенеза.

2. Изучить влияние сфингомиелина и церамида, заключенных в липосомы, на пролиферативную активность и индукцию апоптоза клеток гепатоцеллюлярной карциномы на модели in vitro.

3. Оценить изменение пролиферативной активности и индукции апоптоза клеток печени крыс в процессе развития гепатоцеллюлярной карциномы, а также при курсовом внутривенном введении липосом, содержащих сфингомиелин или церамид, в динамике гепатоканцерогенеза на модели in vivo.

4. Исследовать активность сфингомиелиназы и церамидазы, содержание компонентов цикла сфингомиелина (сфингомиелин, церамид, сфингозин) в норме и в процессе развития гепатоцеллюлярной карциномы, а также после курсового введения липосом, содержащих сфингомиелин или церамид, на фоне развития гепатоцеллюлярного рака.

Научная новизна

Впервые показано, что курсовое введение липосом, содержащих сфингомиелин, на фоне индукции гепатоцеллюлярного рака приводило к более длительному течению воспалительного процесса и задержке формирования гепатоцеллюлярной карциномы до 35 суток по сравнению с группой животных – опухоленосителей, без введения липосом. При введении липосом, нагруженных церамидом, на фоне введения N – нитроздиэтиламина, отмечено наличие минимальной степени выраженности воспалительного процесса и не выявлено структур злокачественных опухолей на протяжении всего периода наблюдений.

Впервые проведено комплексное исследование влияния метаболитов цикла сфингомиелина, заключенных в липосомы на активность пролиферативных процессов и индукцию апоптоза трансформированных гепатоцитов в динамике геаптоканцерогенеза на моделях in vitro и in vivo. Выявлено, что сфингомиелин, введенный в составе липосом, в моделях in vitro и in vivo, на фоне развития гепатоцеллюлярной карциномы приводит к наибольшему подавлению уровня пролиферации и наиболее выраженной индукции апоптоза трансформированных гепатоцитов на ранних стадиях опухолевого роста (до 35 суток). При введении церамида, заключенного в липосомы, аналогичное влияние на изучаемые показатели наблюдалось на поздних стадиях (60 – 90 сутки) формирования гепатоцеллюлярного рака.

Впервые показана корреляционная зависимость между увеличением содержания сфингомиелина и повышением пролиферативной активности клеток гепатоцеллюлярной карциномы в процессе канцерогенеза. При этом отмечена обратная корреляционная зависимость между снижением содержания церамида и сфингозина и повышением пролиферативной активности трансфомированных гепатоцитов.

Установлено, что курсовое введение липосом, нагруженных церамидом на фоне введения N – нитроздиэтиламина iv vivo приводит к активации сфингомиелиназы и церамидазы и повышению содержания церамида и сфингозина с достижением максимальных значений данных показателей на 60 – 90 сутки наблюдений, что способствует, по данным корреляционного анализа, наибольшему снижению пролиферативной активности и индукции апоптоза гепатоцитов на данном этапе наблюдений.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты исследования существенно расширяют фундаментальные представления о механизмах регуляции пролиферативной активности и апоптотической гибели клеток метаболитами сфингомиелинового цикла в динамике гепатоканцерогенеза. Данные о взаимосвязи активности ключевых ферментов сфингомиелинового цикла с интенсивностью процессов пролиферации и апоптоза могут послужить основой для выбора дополнительных информативных критериев при оценке биохимических характеристик трансформированных гепатоцитов, которые, в свою очередь можно использовать в качестве факторов прогноза опухолевой трансформации. Полученные данные показывают принципиальную возможность использования сфингомиелина и церамида с целью ингибирования гепатоканцерогенеза и служить основой для создания новых противоопухолевых и антиканцерогенных средств.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Введение липосом, нагруженных церамидом, приводит к подавлению экспериментального гепатоканцерогенеза, индуцированного N-нитроздиэтиламином, и препятствует формированию гепатоцеллюлярной карциномы.

2. Введение липосом, нагруженных сфингомиелином, в моделях in vitro и in vivo, приводит к наиболее выраженному подавлению пролиферации и индукции апоптоза трансформированных гепатоцитов на ранних стадиях формирования гепатоцеллюлярной карциномы.

3. Введение церамида, заключенного в липосомы, при индукции гепатоцеллюлярного рака на моделях in vitro и in vivo подавляет пролиферацию и активирует апоптотическую гибель трансформированных гепатоцитов на поздних стадиях гепатоканцерогенеза.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Апробация работы

Основные результаты работы представлены на VIII Российско – Корейском Международном симпозиуме (Томск, 2004); на конференции молодых ученых НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН (Томск, 2005); симпозиуме FEBS № 05 – 28W «Recent Advances in Lipid Metabolism and Related Disorders», (Dijon, France, 2005); V Сибирском Физиологическом съезде, (Томск, 2005); 9th International Conference «Eicosanoids and Other Bioactive Lipids in Cancer, Inflammation and Related Diseases», (San Francisco, USA, 2005); Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки», (Тюмень, 2005); на региональной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии», (Томск, 2006); на Всероссийской научно – практической конференции «Онкология сегодня. Успехи и перспективы», (Казань, 2006).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста, иллюстрирована 15 рисунками и 19 таблицами, и состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Результаты и их обсуждение», «Список литературы». Библиография включает 171 литературный источник, в том числе 80 отечественных и 91 иностранных.


МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводились в осенне – зимний период на 235 беспородных крысах обоего пола массой 100 – 150 грам. Животных содержали в стандартных условиях при 20 – 22 градусах с контролируемым световым периодом (12 ч/сутки) на стандартном водном и пищевом рационе.

В исследовании были сформированы следующие группы животных: I - фон (интактные животные); II - животные с индукцией гепатоцеллюлярной карциномы путем введения N - нитроздиэтиламина; III - введение «пустых» липосом, не содержащих сфингомиелин или церамид, на фоне индукции гепатоцеллюлярной карциномы; IV - введение липосом, содержащих сфингомиелин, на фоне индукции гепатоцеллюлярной карциномы; V - введение липосом, содержащих церамид, на фоне индукции гепатоцеллюлярной карциномы. Эвтаназию проводили под эфирным наркозом путем дислокации шейного отдела позвоночника, соблюдая «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденные Министерством Здравоохранения России.


Экспериментальное моделирование гепатоцеллюлярного рака на крысах осуществлялось путем введения 0,02% водного раствора N – нитроздиэтиламина («Sigma Aldrich») c питьевой водой, которую крысы потребляли ad libitum на протяжении всего периода экспериментального исследования [Антониенко С.Г. и соавт., 1990].

Исследование изучаемых показателей в моделях in vitro и in vivo проводили на 14, 28, 35, 60, 90 сутки от начала индукции гепатоцеллюлярной карциномы, что соответствовало стадиям злокачественной трансформации. В эксперименте использовали три типа липосом, содержащие сфингомиелин или церамид («Sigma Aldrich»), либо «пустые» (не содержащие компонентов сфингомиелинового цикла). При выборе сроков и доз введения препаратов руководствовались данными о гепатотропных эффектах липидов в составе липосом [Jarvis W.D., 1994; Cullis P.R., 1996].

Методы исследования

Печень анестезированных крыс перфузировали in situ через портальную вену перфузионной средой (118 мM NaCI, 3 мM Na2HPO4, 2 мM NaH2HPO4, 6 мM MgSO4, 20 мM NaHCO3, 50 мM глюкозы, pH 7,4) [Peterofsky B. 1982, Acosta D., 1985, Kraemer B.L. et al., 1986]. Сбор крови осуществляли через кавальную вену. В качестве опухолевой модели использовали трансформированные клетки печени, выделенные путем перфузии органа раствором коллагеназы in sitи. Материалом для исследований служил гомогенат ткани, контрольные и трансформированные клетки, выделенные путем перфузии печени in sitи.

Приготовление липосом осуществляли по методу Г. Григориадиса (1983). Липосомы состояли из фосфатидилхолина с добавлением липосомального буфера (145мМ NaCI, 10мМ трис НСI, pH 7,4), содержащего 0,2 мг/мл церамида или сфингомиелина («Sigma Aldrich», США). В липосомы включалось 65 % церамида или сфингомиелина, что было показано методом ТСХ.

В экспериментах in vitro в суспензию клеток, добавляли липосомальную взвесь, содержащую сфингомиелин или церамид, в концентрации 0,2 мг/мл. В экспериментах in vivo введение липосом животным в опытных группах осуществляли в хвостовую вену в течение двух недель с интервалом в один день (курс составлял 7 инъекций) на 14 сутки опухолевого процесса (что соотвествовало ранней стадии гепатоканцерогенеза). При каждой инъекции вводилось 33 мкг (0,25 мл) сфингомиелина или церамида в составе липосом на 100 г массы тела животного.

Активность сфингомиелиназы определяли по уменьшению концентрации сфингомиелина методом ТСХ [Brokerhoff H., 1978]. Активность церамидазы определяли по уменьшению концентрации церамида методом ТСХ [Brokerhoff H., 1978].

Содержание сфингомиелина, церамида и сфингозина в гомогенате ткани печени оценивали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). Экстракцию липидов проводили по Фолчу [Folch, 1957]. Хроматограммы окрашивали опрыскиванием пластинки 10 % раствором фосфорномолибденовой кислоты в этаноле. Для количественного определения фракций полоску ТСХ сканировали на сканере «Mustek 1200 USB Plus» и с помощью программы Chrom 3.1 for Windows на персональном компьютере производили количественную оценку.

Регистрацию апоптоза изучали методом оценки степени фрагментации ДНК [Orlov S.N. 1996]. Подсчет количества включенной радиоактивной метки проводили на MicroBeta® TriLux (Perkin Elmer) в сцинтилляторе Lumaх (Lumac systems inc.,США). Анализ фрагментации хроматина проводили по формуле:

(1,5 × (А1t – А10)/(А2 + А1t - 1,5А10)) × 100 %

где А1t – радиоактивность в супернатанте (фрагменты ДНК клеток подвергшихся апоптозу), А2 – радиоактивность в осадке (нефрагментированные ДНК), А10 – контроль.

Уровень синтеза дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в опухолевых клетках измеряли по включению в клетки меченых радионуклидами предшественников синтеза нуклеиновых кислот [3H] – тимидина («Изотоп», Россия). Подсчет количества включенной радиоактивной метки проводили на жидкостном сцинтилляционном счетчике Mark – III (Tracor Analytic) в сцинтилляторе Lumax (Lumac systems inc., США).

Изменение скорости синтеза ДНК вычисляли по формуле:

(О/К) × 100 %

где О – количество импульсов в опытных лунках; К – количество импульсов в лунках, где инкубировались контрольные клетки.

Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием прикладных программ STATISTICA 6.0 Проверку на достоверные различия между группами проводили с помощью непараметрического критерия Манна – Уитни. Для каждого анализируемого показателя вычисляли среднее арифметическое (Х), среднеквадратичное отклонение (SD). Проверку достоверности различий в одной группе на разных этапах исследования проводили с применением непараметрического критерия парных сравнений Вилкоксона. Наличие связи между изучаемыми показателями проводили с использованием корреляционного анализа по методу Спирмена. Статистически значимыми считались различия при p<0,05. Результаты экспериментов приведены в таблицах в виде (Х±SD).

  1   2   3   4

Разместите кнопку на своём сайте:
поделись


База данных защищена авторским правом ©dis.podelise.ru 2012
обратиться к администрации
АвтоРефераты
Главная страница