Роль эндогенной опиоидной системы в формировании экстремальных состояний


НазваниеРоль эндогенной опиоидной системы в формировании экстремальных состояний
страница1/9
ПАРИН Сергей Борисович
Дата конвертации03.09.2012
Размер0,95 Mb.
ТипАвтореферат
СпециальностьФизиология
  1   2   3   4   5   6   7   8   9










На правах рукописи

ПАРИН Сергей Борисович

РОЛЬ ЭНДОГЕННОЙ ОПИОИДНОЙ СИСТЕМЫ В ФОРМИРОВАНИИ ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ СОСТОЯНИЙ







03.03.01 – Физиология







АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени

доктора биологических наук

Москва - 2010


Работа выполнена на кафедре общей и социальной психологии факультета социальных наук Нижегородского государственного университета им. Н.И.Лобачевского и в отделе нейрофизиологии и экспериментального моделирования ЦНИЛ НИИ прикладной и фундаментальной медицины ГОУ ВПО Нижегородской государственной медицинской академии.



Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

доктор филологических наук

Татьяна Владимировна Черниговская





доктор биологических наук

Александр Иванович Федотчев





доктор биологических наук

Александр Яковлевич Каплан



Ведущая организация:

Институт нейрокибернетики им. А.Р.Когана ЮФУ (Ростов-на-Дону)



Защита диссертации состоится «14»_февраля_ 2011 г. в _15.00_ час. на заседании совета Д 501.001.93 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Биологическом факультете МГУ им. М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Воробьёвы горы, МГУ, Биологический факультет, ауд. М-1.


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.


Автореферат разослан «_____»_________________2010 г.



Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор биологических наук





Б.А.Умарова



ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность проблемы. Проблема исследования механизмов экстремальных состояний и стресса, в первую очередь, является сегодня чрезвычайно актуальной, что вполне закономерно, учитывая всё более усугубляющийся пресс техногенной цивилизации. Локальные военные конфликты, техногенные катастрофы, бесконтрольное вмешательство в экологические системы, развивающийся государственный и бытовой терроризм – всё это порождает бесчисленные экстремальные ситуации, требующие для выживания крайнего напряжения функций живого организма. В современной физиологии сложилась традиция определять такие состояния как экстремальные. К их числу принято относить стресс, шок, кому, коллапс, клиническую смерть и т.д. При всех различиях и характерных особенностях они объединяются общим свойством: чрезвычайной нагрузкой как на исполнительные, так и, в первую очередь, на регуляторные системы организма [Вейль, Шубин, 1971; Шутеу и др., 1981; Шустер и др., 1981; Гостищев, 2002].

Сегодня принято считать, что базовым экстремальным состоянием является стресс, или, по определению основателя учения о стрессе Ганса Селье, общий адаптационный синдром. Действительно, стресс может выступать и как основной компонент экстремального состояния, и как формирующий фактор, и как реакция, развивающаяся в ответ на экстремальное воздействие. Достаточно указать на утверждение Г.Селье, относившего шок к стрессу, проявляющемуся в крайней степени [Selye, 1936, 1946]. Учитывая непреходящую актуальность проблемы, можно предположить, что вопрос о механизмах экстремальных состояний хорошо проработан и, в целом, решён. Однако это далеко не так.

В частности, на протяжении многих десятилетий основные физиологические механизмы стресса (и, в большой мере, шока) традиционно сводятся к экстренной активации двух нейро-эндокринных комплексов: симпато-адреналовой системы (САС) и гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы (ГГАС) [Кулагин, 1978; Гаркави и др., 1979; Судаков, 1981, 1997; Монов, 1982; Мазуркевич, Багненко, 2004]. Не вызывает сомнения, что эти две системы, обеспечивая разные компоненты общей активации психических, моторных, метаболических и висцеральных функций, формируют две первые стадии стресса: стадию тревоги и стадию резистентности.

В то же время, очень поверхностно исследованы механизмы третьей стадии стресса - стадии истощения (и, соответственно, фазы торпидности шока), что, во многом, связано с гипнозом классических представлений о них, как о периодах полной дезинтеграции регуляторных и исполнительных механизмов [Selye, 1950; Шутеу и др., 1981; Мазуркевич, Багненко, 2004].

Между тем, начиная с 70-х годов прошлого века, начали накапливаться многочисленные экспериментальные, а затем и клинические данные о существовании третьей нейро-эндокринной системы, играющей существенную роль в регуляции функций организма при экстремальных воздействиях: эндогенной опиоидной системы (ЭОС). Открытие опиатных рецепторов [Pert, Snyder, 1973; Terenius, Wahlstrom, 1973], а затем и опиоидных пептидов [Hughes et al., 1975; Terenius, Wahlstrom, 1975; Teschemacher et al., 1975; Iversen, 1975] стало стимулом для исследования, прежде всего, антиноцицептивных свойств ЭОС [Akil, Watson, 1980; Watkins, Mayer, 1982; Vaccarino, Kastin, 2000]. Наряду с выявлением ведущей роли ЭОС в формировании разных форм подавления болевой чувствительности (медикаментозные, акупунктурные, электростимуляционные и другие воздействия), был обнаружен существенный вклад этой системы в развитие так называемой стресс-анальгезии [Bodnar et al., 1978; Oliverio et al., 1986; Nishith et al., 2002; Bodnar, Klein, 2006], возникающей в ответ на повреждение или его угрозу.

На рубеже 80-х годов были опубликованы первые данные о противошоковом эффекте опиатных блокаторов (налоксона, налорфина, налтрексона) [Faden, Holaday, 1978, 1979, 1980; Holaday, Faden, 1980, 1981; Голанов и др., 1980, 1981, 1982, 1983; Парин и др., 1981, 1982, 1983; Feuerstein et al., 1980, 1983; Curtis, Lefer, 1981, 1983; Hunt et al., 1983; Lechner et al., 1983, и др.], полученные в опытах на разных видах животных (мыши, крысы, морские свинки, кролики, кошки, собаки и т.д.) при использовании разных экспериментальных моделей шока (геморрагическом, электроболевом, эндотоксиновом, экзотоксиновом, окклюзионном, спинальном и т.п.). Использование опиатных антагонистов в противошоковой терапии было запатентовано [Голанов и др., 1980; Holaday, Faden, 1980] и начало внедряться в реаниматологическую клиническую практику. Однако результаты клинического применения опиатных антагонистов оказались менее убедительными, чем можно было ожидать. В 2003 году был опубликован аналитический обзор B.Boeuf et al. («Naloxone for shock»), в котором авторы, сугубо дилетантски проанализировав несколько десятков клинических случаев использования опиатных антагонистов при шоке, пришли к выводу, что данная медицинская технология далеко не всегда приносит желаемый эффект, так как, хотя и приводит к существенному улучшению показателей висцеральных функций, значимо не влияет на выживаемость пациентов. Широко растиражированный обзор привёл к заметному снижению интереса клиницистов-реаниматологов и, соответственно, экспериментаторов к опиатным блокаторам. Между тем, причина возникшей стагнации связана вовсе не с низкой эффективностью новой технологии (грамотное применение налоксона при «необратимом» шоке спасло уже множество жизней) и не с методической легкомысленностью авторов упоминавшегося аналитического обзора, а с методологическим тупиком, обусловленным неоправданным увлечением зарубежных (а отчасти и отечественных) нейробиологов выяснением деталей лиганд-рецепторных взаимодействий, или же созданием коллекции купированных налоксоном экспериментальных разновидностей шока. Было потеряно фундаментальное направление исследования: системный анализ механизмов участия ЭОС в динамике экстремальных состояний.

Цель и задачи исследования. Целью нашей работы явилось изучение системных механизмов участия эндогенной опиоидной системы в формировании и развитии таких экстремальных состояний, как стресс, шок и клиническая смерть.

Для достижения цели было необходимо решить следующие базовые задачи:

1. Изучить динамику уровня опиоидных пептидов в мозгу и плазме крови животных при разных видах шока.

2. Исследовать влияние лигандов опиатных рецепторов на динамику висцеральных и неврологических функций и исход при разных видах шока.

3. Провести проверку «эндолоксоновой» гипотезы: проанализировать возможное участие параопиоидных пептидов семейства FaRPs в саногенезе экстремальных состояний.

4. Изучить динамические режимы стресс-анальгезии, вызванной различными стрессорами.

5. Исследовать динамику психических и психофизиологических функций при разных видах повреждения или его угрозы.

6. Провести проверку трёхкомпонентной теории стресса и шока на математической модели.

Научная новизна. Впервые в рамках одной работы проведено систематическое исследование участия ЭОС в развитии принципиально различных по этиологии и различающихся по степени выраженности видов стресса и шока, что позволило выявить системные закономерности стадийной динамики этих процессов. Впервые показана эффективность блокады опиатных рецепторов при электроболевом, болевом, экзотоксиновом и випериновом шоке. В работе впервые показана зависимость эффектов блокады опиатных рецепторов при разных видах шока от доз и сроков введения опиатных антагонистов. Впервые продемонстрирована значимость паравентрикулярных отделов гипоталамуса для реализации эффектов опиоидных пептидов при шоке. Выявлена взаимосвязь динамики опиоидных пептидов и их прекурзоров в мозгу и крови при разных видах шока. Обнаружен противошоковый эффект пептидов семейства FaRPs и исследованы его возможные механизмы. Выявлена независимость стресс-анальгезии от вида стрессоров и пороговый характер вовлечения ЭОС. Показан вклад ЭОС в изменения психических и психофизиологических функций при стрессе различной этиологии. Сформулирована и проверена на математической модели трёхкомпонентная теория стресса и шока, основанная на динамическом взаимодействии трёх стресс-реактивных систем: САС, ГГАС и ЭОС.

Теоретическая и практическая значимость. Работа вносит вклад в разработку биологической концепции системных механизмов экстремальных состояний. Показана общность базовых механизмов стресса и шока и характер вовлечения в них ЭОС. Благодаря исследованию динамики висцеральных, неврологических и психических функций при экстремальных состояниях выявлены общие механизмы стадийности этих процессов, обусловленные общностью изменений активности базовых регуляторных систем: САС, ГГАС и ЭОС.

Практическая значимость работы определяется, прежде всего, разработанными и защищёнными патентами способами противошоковой терапии, основанными на коррекции функций ЭОС. Обоснованы дозы и сроки применения опиатных антагонистов при шоке. Предложен и запатентован способ экспериментального моделирования отёка лёгких с помощью параопиоидных пептидов. Разработанная математическая модель шока и стресса является основой для создания симулятора экстремальных состояний, обеспечивающего диагностику, мониторирование и прогнозирование экстремальных состояний.

Положения, выносимые на защиту:

  1. Закономерно сходные изменения содержания эндогенных опиоидов в мозгу и плазме крови животных при экзотоксиновом. випериновом и геморрагическом шоке указывают на стадийную гиперактивацию ЭОС в ответ на повреждающее воздействие.

  2. Блокада опиатных рецепторов на торпидных фазах злектроболевого, электрического, геморрагического, экзотоксинового и виперинового шока, равно как и разрушение паравентрикулярной области гипоталамуса при электроболевом шоке, существенно улучшает висцеральные и неврологические функции и увеличивает продолжительность жизни и выживаемость животных. Опиатные антагонисты, вводимые на эректильной и терминальной фазах, также как и опиатные агонисты, ухудшают состояние животных.

  3. Параопиоидные пептиды семейства FaRPs проявляют реанимирующее действие при гипобарической гипоксии и острой геморрагии, когда блокада опиатных рецепторов неэффективна. Эффект FaRPs реализуется через адренергические механизмы, что может свидетельствовать об участии параопиоидных пептидов в саногенезе экстремальных состояний.

  4. Независимо от характера стрессора (использование принципиально разных по химизму и механизмам действия зоотоксинов в низких дозах), развивающаяся стресс-анальгезия имеет двухфазную динамику, устраняемую опиатными блокаторами.

  5. Сходство динамики психологических, психофизических и психофизиологических показателей при утомлении у программистов, на стадии истощения при экзаменационном стрессе у студентов, при посттравматическом стрессовом синдроме у ветеранов локальных военных конфликтов и у лиц, страдающих опиатной наркотической зависимостью, свидетельствует о ведущей роли ЭОС в формировании гипобиотического состояния при стрессе.

  6. Стресс является неспецифической системной защитной стадийной редуцированной психофизиологической реакцией на повреждение или его угрозу. Шок является частным случаем этой реакции, развивающимся в ответ на сверхсильное (потенциально смертоносное) повреждение. Динамика этих процессов обусловлена синхронным запуском трёх базовых стресс-реактивных систем, каждая из которых доминирует на своей стадии (фазе): активность САС предопределяет развитие кратковременной начальной гиперактивации функций, ГГАС формирует относительно устойчивую активацию на стадии резистентности (в первичной торпидной фазе), а ЭОС обеспечивает гипобиотическую минимизацию функций на завершающих этапах стресса и шока.

Апробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на III Международном симпозиуме по апитерапии (Бухарест, Румыния, 1979); Всесоюзной конференции «Физиология вегетативной нервной системы» (Куйбышев, 1979); XI Всероссийской конференции по физиологии и патологии кортико-висцеральных взаимоотношений, посвященной 50-летию отдела физиологии висцеральных систем им. академика К.М.Быкова (Ленинград, 1981); V Всесоюзной герпетологической конференции (Ленинград, 1981); VI Всесоюзной конференции по экологической физиологии «Общие проблемы экологической физиологии» (Сыктывкар. – 1982); V Всесоюзной конференции по физиологии вегетативной нервной системы, посвященной 100-летию со дня рождения академика Л.А.Орбели (Ереван, 1982); XV съезде Всесоюзного физиологического общества им. И.П.Павлова (Кишинев, 1987); Всесоюзной конференции «Проблемы нейрогуморальной регуляции деятельности висцеральных систем, посвященной 90-летию со дня рождения академика В.Н.Черниговского» (Ленинград, 1987); Международном симпозиуме «Центральная нервная система и постреанимационная патология организма» (Москва, 1989); I Всесоюзной токсинологической конференции «Проблемы теоретической и прикладной токсинологии» (Ашхабад, 1991); Научной конференции, посвящённой 150-летию кафедры физиологии человека и животных Киевского университета им. Т.Шевченко (Киев, Украина, 1992); III Международном симпозиуме по сравнительной электрокардиологии (Сыктывкар, 1993); 33-м Интернациональном апикультуральном конгрессе «Apimondia» (Пекин, Китай, 1993); Российской научной конференции «Антигипоксанты и актопротекторы» (Санкт-Петербург, 1994); Х Всероссийском пленуме правления общества и федерации анестезиологов и реаниматологов «Анестезия и интенсивная терапия при травме, гипоксия, эндотоксемия и методы их коррекции» (Нижний Новгород, 1995); 34-м Интернациональном апикультуральном конгрессе «Apimondia» (Лозанна, Швейцария, 1995); VII Всероссийском съезде неврологов (Нижний Новгород, 1995); I конференции герпетологов Поволжья (Тольятти, 1995); II съезде биохимического общества РАН (Москва, 1997); . IV Международном симпозиуме по сравнительной электрокардиологии «Сравнительная электрокардиология – 97» (Сыктывкар, 1997); VI Российском съезде травматологов и ортопедов (Нижний Новгород, 1997); Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 150-летию со дня рождения академика Ивана Петровича Павлова (Санкт-Петербург, 1999); III Международном симпозиуме «Физиологические механизмы природных адаптаций» (Иваново, 1999); Международной конференции «Комбустиология на рубеже веков» (Москва, 2000); Международной конференции «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов» (Петрозаводск, 2004); Научной сессии МИФИ-2005: VII Всероссийской научно-технической конференции «Нейроинформатика - 2005» (Москва, 2005); I Съезде физиологов СНГ (Пицунда, 2005); 14-й Международной конференции по нейрокибернетике (Ростов-на-Дону, 2005); Научной сессии МИФИ-2006: VIII Всероссийской научно-технической конференции «Нейроинформатика - 2006» (Москва, 2006); II Троицкой конференции "Медицинская физика и инновации в медицине" (Троицк, 2006); Научной сессии МИФИ-2007: IХ Всероссийской научно-технической конференции «Нейроинформатика – 2007» (Москва, 2007); ХХ съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007); Международном симпозиуме “Пространство проблем биофотоники (TPB-2007)” (Нижний Новгород - Москва, 2007); Научной сессии МИФИ-2008: Х Всероссийской научно-технической конференции «Нейроинформатика - 2008» (Москва, 2008); III Международной конференции по когнитивной науке (Москва, 2008); II Всероссийской научно-практической конференции «Функциональное состояние и здоровье человека» (Ростов-на-Дону, 2008); II съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека» (Молдова, Кишинэу, 2008); V Всероссийской конференции-школы по физиологии слуха и речи (Санкт-Петербург, 2008); Всероссийской конференции, посвящённой 125-летию со дня рождения академика Л.А. Орбели «Научное наследие академика Л.А.Орбели. Структурные и функциональные основы эволюции функций, физиология экстремальных состояний» (Санкт-Петербург, 2008); Научной сессии МИФИ-2009: ХI Всероссийской научно-технической конференции «Нейроинформатика - 2009» (Москва, 2009); Всероссийской конференции «Нелинейная динамика в когнитивных исследованиях» (Нижний Новгород, 2009); XV Международной конференции по нейрокибернетике (Ростов-на-Дону, 2009); Седьмой Национальной конференции «Рентгеновское, Синхротронное излучение, Нейтроны и Электроны для исследования наносистем и материалов: Нано-Био-Инфо-Когнитивные технологии» (РСНЭ – НБИК 2009) (Москва, 2009); Научной сессии НИЯУ МИФИ-2010 «Актуальные вопросы нейробиологии, нейроинформатики и когнитивных исследований» (Москва, 2010); IV Международной конференции по когнитивной науке (Томск, 2010); XV Всемирном конгрессе по психофизиологии (Будапешт, Венгрия, 2010); XXI съезде Физиологического общества им. И.П.Павлова (Калуга, 2010), и др.

Публикации. Результаты исследований опубликованы в 128 работах, в числе которых 32 – в изданиях, рекомендованных ВАК, и 27 – в рецензируемых сборниках трудов и журналах. Получено 1 авторское свидетельство СССР и 3 патента РФ (в соавторстве).

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 глав, заключения и списка цитируемой литературы, включающего 1105 источников. Общий объём работы - 390 стр., включая 60 рисунков и 85 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ



ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты были проведены на 7 видах животных, для каждой конкретной серии опытов объекты выбирались в соответствии с задачами. В опытах участвовали: дафнии (312 особей), травяные лягушки (18), мыши (1046), крысы (1197), кролики (62), кошки (11), павианы гамадрилы (27). Кроме того, одним из объектов исследования были люди, добровольно дававшие информированное согласие на обследование (студенты, программисты, ветераны локальных военных конфликтов, наркоманы – всего 644 человека).

В каждой конкретной серии экспериментов использовались методы, адекватные локальным задачам исследования.

Электрофизиологические методы. Регистрация электроэнцефалограммы (ЭЭГ) и событийно-связанных потенциалов (ССП) в ответ на электрокожное раздражение и световую и звуковую стимуляцию осуществлялась у животных при моно- и биполярном отведении с 8, 12 и 16 стальных игольчатых макроэлектродов (с индифферентным электродом, расположенном в лобной кости), предварительно (не менее чем за 1 сутки до опыта) имплантированных в кости черепа, и зафиксированных на поверхности черепа с помощью норакрила. Сигнал с электродов подавался на электроэнцефалографы Galileo или Bioscript, а с них – на один из каналов чернильнопишущего регистратора Н338-4П и на один из каналов стереофонического магнитофона “Тембр-2” или 16-канального магнитографа (после предварительной частотно-импульсной модуляции). В ходе экспериментов осуществлялся автоматический спектральный анализ ЭЭГ с помощью анализатора спектра низких частот “С4-54” в реальном масштабе времени за эпоху усреднения 10 с, в диапазоне частот 0,5-20,0 Гц при полосе анализа 0,1 Гц, с последующим усреднением амплитуд спектральных составляющих в интервалах частот 0,5-3,5, 3,5-8,0, 8,0-13,0, 13,0-20,0 Гц. Спектральному анализу подвергалась также ЭЭГ, записанная предварительно на ленту магнитографа.

Для спектрального анализа предварительно записанных эпизодов ЭЭГ использовалась анализирующая установка, включающая: анализатор спектра вычислительный “СК4-72/2” (состоящий, в свою очередь, из анализатора спектра “С4-73”, блока измерительного “Я4С-76” и интегратора многоканального “Я4С-78”), осциллограф универсальный запоминающий “С8-13”, анализатор спектра “С4-54”, два осциллографа “С1-55”, вольтметр цифровой “Щ13-12” и электростимулятор “ЭСЛ-1”. Установка использовалась для экспресс-анализа и последующей обработки энцефалограмм. Вызванные потенциалы сенсомоторной области коры фотографировались с экрана осциллографа Disa методом суперпозиции по 5 предъявлениям.

Изучение изменений вегетативных и неврологических параметров, а также уровня выживаемости животных производилось стандартными методами. У животных в ходе экспериментов регистрировались следующие показатели: выраженность роговичного рефлекса, ЭКГ (в I и II стандартных отведениях), артериальное давление (прямым способом), параметры внешнего дыхания, реоэнцефалограмма (РЭГ), температура тела, продолжительность жизни животных.

Регистрация ЭКГ у животных производилась с игольчатых стальных электродов, введённых подкожно в конечности животных. Запись кардиограммы проводили на ленте энцефалографа ЭЭГ-4 или же с помощью чернильнопишущего регистратора “Н338-4П”. В последнем случае в качестве предусилителя использовался двухканальный полианализатор с цифровой индикацией “ПАЗ-01”.

В экспериментах с участием добровольцев запись ЭКГ в трёх стандартных отведениях осуществлялась с помощью программно-аппаратных комплексов ЭЭГА-21/26 «Энцефалан – 131 - 03» или Нейрософт «ВНС Микро». Для оценки типа вегетативной регуляции использовался метод кардиоинтервалографии (КИГ). Расчёт параметров частотной компоненты спектра R–R интервалов проводился в соответствии со стандартами Европейского Кардиологического Общества и Северо-Американского общества стимуляции и электрофизиологии. Для анализа использовались следующие спектральные интервалы частот: HF (High Frequency) – 0,15-0,40 Гц; LF (Low Frequency) – 0,04-0,15 Гц; VLF (Very Low Frequency) – 0,003-0,04 Гц. Вычислялся коэффициент симпатико-парасимпатического баланса LF/HF.

Запись отдельных параметров внешнего дыхания осуществлялась с помощью заполненной угольным порошком резиновой манжетки, которой обвязывалась грудная клетка животного. Изменения степени натяжения трубки вызывали колебания сопротивления заполнявшего её порошка, эти колебания подавались на один из каналов реографа РГ4-01, в мостовую схему которого манжетка включалась в качестве переменного резистора. В результате на одном из каналов регистратора отмечались характерные дыхательные волны, отражавшие частоту и глубину дыхания животного. РЭГ регистрировалась стандартным способом с помощью реографа РГ4-01.

Определение артериального давления осуществлялось, в зависимости от серий экспериментов, или ртутным манометром, или же с помощью электроманометров Barowar или RFT. Запись артериального давления в двух последних случаях производилась на ленте регистратора без дополнительного усиления. Полиэтиленовый катетер для регистрации артериального давления вживлялся наркотизированным животным в следующие артерии: кроликам и кошкам – в бедренную, крысам и павианам гамадрилам – в хвостовую или правую сонную. Катетер перед установкой заполнялся физиологическим раствором с незначительным количеством коммерческого раствора гепарина.

Температура тела животных регистрировалась с помощью медицинского электротермометра “ТПЭМ-1” посредством ректального датчика. Роговичный рефлекс у ненаркотизированных животных оценивался с помощью специальной волосковой касалки.

Радиоиммунологические методы анализа.Для радиоиммунологического определения изменений уровня β-эндорфина в тканях мозга и в плазме крови у крыс и павианов гамадрилов использовался стандартный коммерческий набор реагентов фирмы Immuno Nuclear Corporation (INC), предназначенный для стандартного тестирования данного пептида [Ткачёва и др., 1983]. Набор представляет собой классическую радиоиммунологическую систему с добавлением полиэтиленгликоля к вторичной антисыворотке для лучшего осаждения связанного антителом меченого пептида. Чувствительность теста составляет 10,0 нг/л (по данным инструкции набора).

Определение опиоидной иммунореактивности осуществлялось, в основном, квалифицированными специалистами лаборатории радиоизотопной диагностики Нижегородской областной больницы им. Н.А. Семашко и Всесоюзного центра психического здоровья (Москва). Подсчёт радиоактивности в пробах производился на автономном гамма-счётчике фирмы Alwar (Швеция). Параллельно аналогичным образом проводилось радиоиммунологическое определение уровня АКТГ и бета-липотропина. В ряде случаев также проводили радиоиммунологическое определение суммарного содержания β-эндорфиноподобной / β-липотропиноподобной иммунореактивности с помощью стандартного набора фирмы «Seragen» (США).

Поведенческие тесты. Определение общей двигательной активности (ОДА) животных производилось в специальной камере для поведенческого тестирования размером 800х400х400 мм, выполненной из органического стекла. К подвижному полу камеры жестко фиксировался медицинский пьезоэлектрический акселерометр ПАМ-I (производства ИПФ РАН). Механические колебания, преобразованные пьезоакселерометром в электрический сигнал, подавались непосредственно на вход четырёхканального чернильнопишущего электроэнцефалографа ЭЭГ-4.

Определение уровня ноцицептивной чувствительности животных производилось с помощью поведенческих и электрофизиологических методик. В качестве ноцицептивных раздражителей использовались следующие стандартные стимулы: термическое световое раздражение корня хвоста (tail-flick test) [D’Amour, Smith, 1941] или кожи спины, термическое “контактное” раздражение лап (hot-plate test) [O’Callaghan, Holtzman, 1975], электрическое раздражение корня хвоста, электрокожное раздражение (ЭКР).

Ноцицептивные стимулы использовались для оценки латентных периодов защитных поведенческих реакций животных, характеризующих временные пороги их болевой чувствительности. Параметры стимуляции подбирались в различных сериях экспериментов с целью минимизации наносимого повреждения. Электрокожное раздражение, так же как и электростимуляция корня хвоста, наносилось от стимулятора ЭСТ-14 через его изолирующую приставку (производства ЭПМ ИЭМ, Ленинград). Параметры стимуляции в каждом конкретном случае подбирались индивидуально с тем расчётом, чтобы в условиях свободного передвижения нанесение раздражения вызывало у животных аверсивную реакцию (попытку к бегству). Стимулы представляли собой одиночные (1 удар в 3-4 с) прямоугольные импульсы тока силой 3-7 мА и длительностью 1-2 мс, или же пачки импульсов длительностью 1 мс с частотой 50 Гц, силой тока 5 мА и длительностью пачки 1 с. Для дифференцировки угнетения ноцицептивной чувствительности от общей гипосенсории и в экспериментах с выработкой условных рефлексов нами использовалась световая и звуковая стимуляция животных, для чего вспышки света мощностью 0,5 Дж подавались с расстояния 200 мм от глаза животного, а звуковой сигнал частотой 1000 Гц и амплитудой 60 дБ – через динамик с помощью фотофоностимулятора Sonneclat.

Психофизические методы. Для количественной оценки первичных когнитивных функций у испытуемых нами использовались компьютерные методы латерометрии и кампиметрии [Полевая, 2008, 2009]. Компьютерная кампиметрия обеспечивает измерение порогов цветоразличения в виртуальном цветовом пространстве. Компьютерная латерометрия обеспечивает измерение дифференциальных порогов пространственного слуха при латерализации дихотического стимула.

Методы психологического тестирования. В экспериментах с участием добровольцев в качестве вспомогательных средств использовались стандартные психологические опросники (тест для определения уровня ситуативной и личностной тревожности Спилбергера-Ханина, САН – «Самочувствие-Активность-Настроение», СОС [Орлов, 2008], ОТС - Опросник Травматического Стресса [Котенёв, 1997]) и цветовой тест Люшера.

Методы фармако-физиологического анализа. Для реализации стандартной процедуры фармако-физиологического анализа [Гацура, Саратиков, 1977] использовались различные фармакологические агенты с определённым механизмом действия. Прежде всего, это средства, прицельно влияющие на характер синаптической передачи: агонисты и антагонисты соответствующих рецепторов, деплеторы, энзимные ингибиторы, ингибиторы обратного захвата медиаторов и т.д.

В частности, для тестирования катехоламинергических механизмов применялись: агонисты преимущественно β-адренорецепторов адреналин и α-адренорецепторов норадреналин, неизбирательный блокатор α-адренорецепторов преимущественно периферического действия дигидроэрготамин, агонист преимущественно центральных α2-адренорецепторов клофелин, неселективный антагонист β-адренорецепторов пропранолол (обзидан), блокатор центральных и периферических адренорецепторов и дофаминовых рецепторов аминазин, деплетор катехоламинов резерпин, блокатор дофаминовых рецепторов галоперидол. Использовались ганглиоблокаторы пентамин и бензогексоний; m-холинолитик атропин; антагонисты ГАМК-рецепторов бикукулин, баклофен и пикротоксин; противогистаминные средства димедрол, пипольфен, и т.д.

Для анализа опиоидных механизмов применялись: опиатные агонисты морфина гидрохлорид и фентанил, опиатные антагонисты налоксон (налоксона гидрохлорид; «Наркан», Эндо Дюпон, США) и налтрексон, частичный опиатный антагонист налорфин. Кроме того, использовались следующие опиоидные и параопиоидные пептиды, синтезированные в КНЦ РАМН: пентапептиды YGGFM (мет-энкефалин) и YGGFL (лей-энкефалин), тетрапептиды FMRFамид и YMRFамид, дипептиды RFамид и RFгидрохлорид, гептапептид YGGFMRFамид (Arg6-Phe7-мет-энкефалинамид, возможный предшественник FMRFa), гексапептид YdAGFLRx2CH3COOH (даларгин, d-Ала2-Арг6-лей-энкефалин). В ряде серий экспериментов применялись рилизинг-гормоны кортиколиберин (“CRH”) и тиролиберин (“TRH”), а также пептидный препарат семакс (“ACTH4-7”-PGP).

Кроме того, часть обследованных добровольцев по медицинским показаниям принимала психотропные препараты нескольких фармакологичеких групп: нейролептики (азалептин, аминазин, галоперидол, рисполепт, сероквель, солиан, сонапакс, сульпирид, трифтазин, труксал, хлорпротиксен), транквилизаторы (бензонал, феназепам, нозепам), антидепрессанты (амитриптилин, анафранил, коаксил, мелипрамин, продеп, стимултон, феварин, флуоксетин, ципралекс) и антиконвульсанты (глюферал, карбомозепин, клоназепам, паглюферал, циклодол). Принимавшие участие в обследовании лица, страдающие наркотической зависимостью, употребляли наркотические анальгетики: морфина гидрохлорид, героин и фентанил.

В качестве дозируемых стрессоров с принцпиально разными химическим строением и мишенями в организме [Каменская, 1982] были использованы зоотоксины различных систематических групп. Лиофилизированные яды среднеазиатской и формозской (тайваньской) кобры, гюрзы, эфы и обыкновенной гадюки были получены из змеепитомника Ташкентского института зоологии и паразитологии АН Узбекистана. Яды зелёной жабы и пятнистой саламандры были получены во время экспедиций путём механической стимуляции кожных желёз. Пчелиный яд был получен методом электрической стимуляции пчёл с помощью аппарата НИИХ-5, сконструированного в ННГУ. Мазь, изготовленная на основе пчелиного яда (условное название “Унгапивен”) была предоставлена Рижским медицинским институтом. Содержание пчелиного яда в ней составляло (в трёх различных вариантах) соответственно 0,06%, 0,015% и 0,1%; в качестве основы использовался полиэтиленоксид. При моделировании виперинового шока дополнительно применялась противозмеиная сыворотка “Антигюрза” (серия 30 контр. № 3753) Ташкентского научно-исследовательского института вакцин и сывороток. Определение токсичности (в частности, ЛД50) использованных в экспериментах ядов не входило в цели нашего исследования и производилось на предварительных стадиях исследования общепринятым методом пробит-анализа по Личфилду-Уилкоксону.

В качестве вспомогательных средств использовались: уретан, хлоралоза, натрия пентобарбитал, эфир, гепарин, стерилизованный изотонический раствор хлорида натрия и т.д. Все растворы соответствующих концентраций готовились на стандартном изотоническом растворе хлорида натрия непосредственно перед введением. Введение веществ осуществлялось или в мозговые желудочки, или внутрибрюшинно, или в краевую вену уха, или же через предварительно имплантированные катетеры – в бедренную, хвостовую или внутреннюю ярёмную вену животных. Все области, подвергавшиеся оперативному вмешательству или введению электродов, предварительно анестезировались 2-процентным раствором новокаина.

Биохимические методы. В работе проводилось определение концентрации глюкозы в плазме крови крыс гексокиназным методом на биохимическом анализаторе «Express plus (V-560)» (Ciba-Corning, Англия).

Методы обработки экспериментальных данных. При обработке полученных данных использовались стандартные параметрические и непараметрические методы спектрального, корреляционного и дисперсионного анализов (t-критерий Стьюдента, d-критерий Фишера, критерий Уилкоксона-Манна-Уитни, линейные, частные и сводные коэффициенты корреляции и т.д.). Использовались ресурсы Microsoft Excel, Статистика версия 6.1, программ «Стадия» и «Академия».


РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изменения уровня опиоидных пептидов в организме животных при различных повреждающих воздействиях

Опираясь на предположение, что эндогенные опиоидные пептиды вовлекаются во многие физиологические процессы, в том числе в формирование ответной реакции организма на стрессовые воздействия, в первой серии экспериментов, проведённой в институте экспериментальной патологии и терапии АМН СССР в Сухуми, мы определяли уровень β-эндорфиноподобной иммунореактивности (β-ЭПИР) в плазме крови у павианов гамадрилов и изучали ее изменения в ряде экспериментальных контекстов. Эксперименты были выполнены на 6 павианах гамадрилах (Papiо hamadryas) массой 5,5—8,5 кг. Электрическую стимуляцию (ЭС) гипоталамических структур осуществляли монополярными прямоугольными импульсами длительностью 10 мс, частотой 50 Гц и силой тока 4—5 мкА. Геморрагический шок моделировали кровопусканием из плечевой вены у животных, находящихся в состоянии наркотического сна (хлоралоза, 80 мг/кг, внутривенно).

Фоновый уровень β-ЭПИР в плазме крови у павианов гамадрилов, находившихся в состоянии спокойного бодрствования, составил 8,0±1,0 фмоль/мл. Суммарный уровень β-ЭПИР и β-ЛПИР составил 134±24 пг/мл. Вычислительный уровень β-ЛПИР составил 9,0±1,0 фмоль/мл (рис. 1-IА). У 2 животных кровь забирали 3-кратно на протяжении 7 суток. Фоновый уровень β-ЭПИР и вычисленный уровень β-ЛПИР оставались стабильными на протяжении всего времени эксперимента (рис. 1-IБ).

У 2 животных после установления фонового уровня β-ЭПИР кровь брали на фоне электростимуляции (через 30 секунд после ее начала) паравентрикулярно-перифорникальной области медиального гипоталамуса, которая участвует в обеспечении вегетативного компонента эмоциональных реакций. Электростимуляция данной области сопровождалась выраженным беспокойством животных, повышением среднего артериального давления — АД (со 100 до 190 мм рт. ст.), тахикардией и тахипноэ, что позволило предположить стрессогенный характер этого воздействия. Уровень β-ЭПИР в плазме крови возрастал на 189%, одновременно наблюдалось небольшое увеличение суммарного содержания β-ЭПИР и β-ЛПИР. Уровень вычисленной β-ЛПИР, соответственно, снижался (рис. 1-IВ). У 2 животных кровь брали на фоне электростимуляции мамиллярной области гипоталамуса. У них также имели место, хотя и менее выраженные, сдвиги вегетативных показателей: гипертензия (повышение АД от 98 до 150 мм рт. ст.), тахипноэ, тахикардия. В этих случаях отмечалось недостоверное возрастание уровня β-ЭПИР, некоторое увеличение суммарного содержания β-ЭПИР и β-ЛПИР, вычисленные значения содержания β-ЛПИР незначительно снижались (рис. 1-IГ).




I





II





III





IV






Рис. 1. Сравнительная динамика β-эндорфиноподобной иммунореактивности (β-ЭПИР) и β-липотропиноподобной иммунореактивности (β-ЛПИР) в плазме крови павианов гамадрилов в норме (IА), в среднем по трём замерам в течение недели (IБ), при электростимуляции паравентрикулярно-перифорникальной (IВ) и мамиллярной (IГ) областей гипоталамуса, а также при геморрагическом шоке (II); β-ЭПИР в ткани мозга и плазме крови крыс при экзотоксиновом шоке (III); а также β-ЭПИР и АКТГ в плазме крови крыс при випериновом шоке (IV). Звёздочками обозначены достоверные отличия показателей от фонового уровня (при p<0,05).




Еще у 2 животных исследовали изменение уровня β-ЭПИР, суммарного уровня β-ЭПИР и β-ЛПИР при развитии геморрагического шока (рис. 1-II). Кровь у них брали 3-кратно: перед началом кровопускания (после наступления наркотического сна), через 20 минут, в течение которых уровень среднего АД поддерживали повторными кровопусканиями на уровне 50 мм рт. ст., и через 60 минут после окончания кровопускания (оба животных погибли на фоне нарастающего шока). До начала кровопускания уровни β-ЭПИР и β-ЛПИР соответствовали контрольным значениям. Через 20 минут уровень β-ЭПИР возрос на 300%. Суммарное содержание β-ЭПИР и β-ЛПИР практически не изменялось. Уровень β-ЛПИР достоверно снизился. Через 60 минут после окончания кровопускания содержание β-ЭПИР возросло еще на 47 % по сравнению с ее уровнем в предшествующий период.

Таким образом, в плазме крови павианов гамадрилов содержатся измеримые количества как β-ЭПИР, так и β-ЛПИР, причём уровень β-ЭПИР и β-ЛПИР, циркулирующих в крови в нормальных условиях, достаточно стабилен. Обнаружено, что стимуляция паравентрикулярно-перифорникальной области медиального гипоталамуса, где лежат тела опиоидергических нейронов, вызывая вегетативные сдвиги у животных, характерные для стресса, приводит также и к значительному возрастанию содержания β-эндорфина в плазме крови, при этом наблюдается смещение соотношения β-ЭПИР/β-ЛПИР в сторону β-ЭПИР. В то же время, стимуляция мамиллярной области гипоталамуса не приводит к столь выраженным изменениям уровней β-ЭПИР и β-ЛПИР. Это может свидетельствовать об участии паравентрикулярных и перифорникальных отделов гипоталамуса в высвобождении β-эндорфина при стрессе.

Еще более выраженное повышение содержания β-ЭПИР в плазме крови наблюдается при развитии геморрагического шока, при этом уровень β-ЛПИР снижается в еще большей степени (рис. 1-II). Все эти данные показывают, что повышение уровня β-ЭПИР в плазме крови сопровождает формирование стресса, в том числе, развитие шокового состояния у павианов гамадрилов. Определенное значение в регуляции содержания β-эндорфина в плазме может играть паравентрикулярно-перифорникальная область медиального гипоталамуса. Повышение уровня β-эндорфина, вероятно, происходит как за счет усиления расщепления β-липотропина, так и за счет увеличения синтеза последнего в гипофизе.

В следующих сериях опытов (на 142 крысах-самцах) тот же метод был использован нами для определения уровня бета-эндорфина и АКТГ в тканях мозга и плазме крови крыс при экзотоксиновом шоке, вызванном введением 2ЛД50 нейротропного яда кобры (рис. 1-III), и випериновом шоке, вызванном введением 2ЛД50 гематотропного яда гюрзы (рис. 1-IV).

Определение уровня β-ЭПИР в тканях мозга и плазме крови крыс при отравлении их двойной полулетальной дозой яда кобры позволило выявить сходную, в целом, динамику этого показателя в крови и мозгу в процессе развития шока (рис. 1-III). Вслед за начальным повышением уровня β-ЭПИР уже к десятой минуте после введения яда наблюдалось существенное снижение этого показателя, отмечавшееся вплоть до тридцатой минуты после инъекции. При дальнейшем развитии интоксикации концентрация β-ЭПИР в тканях переднего мозга резко возрастала, достигая к шестидесятой минуте эксперимента значений, многократно превышающих фоновые показатели.

Характерно, что налицо не только однонаправленность изменения содержания эндопиоидов в мозгу и плазме крови крыс, но и некоторое запаздывание по времени колебаний уровня пептидов в плазме крови по сравнению с их тканевым содержанием в мозгу. Кроме того, исследование изменений содержания β-ЭПИР в тканях переднего мозга и плазме крови крыс в процессе развития интоксикации ядом кобры позволило выявить двухфазный характер изменений этого показателя, свидетельствующий о существенных колебаниях опиоидной активности, что может быть связано как с изменением интенсивности процессинга эндогенных опиоидных пептидов, так и с модификацией связывания пептидных лигандов с опиатными рецепторами.

При введении двойной полулетальной дозы яда гюрзы уже на начальном этапе виперинового шока наблюдалось значительное повышение концентрации β-ЭПИР в крови, после чего её значения относительно стабильно удерживаются на этом уровне на протяжении всего периода развития интоксикации (рис. 1-IV). Аналогичным образом изменялся и уровень АКТГ в плазме крови, однако степень увеличения концентрации кортикотропина была значительно больше.

Сходство характера колебаний уровня β-эндорфина и АКТГ, очевидно, указывает на общность механизмов, обеспечивающих их проявления. Это вполне объяснимо, так как в экстремальных состояниях оба пептида могут протеолитически выщепляться из одного общего гипофизарного прекурзора.

В целом результаты радиоиммунологического анализа подтверждают исходную гипотезу о существенной роли ЭОС в развитии экстремальных состояний. В связи с этим экспериментальная проверка эффективности использования полных или частичных опиатных антагонистов для купирования чрезмерной активности ЭОС при шоке различной этиологии представлялась весьма важной и перспективной.

  1   2   3   4   5   6   7   8   9

Разместите кнопку на своём сайте:
поделись


База данных защищена авторским правом ©dis.podelise.ru 2012
обратиться к администрации
АвтоРефераты
Главная страница